Vào ngày 22 tháng 11 năm 1963, trong một chuyến công du chính trị, Tổng thống Kennedy đã bị ám sát. Vào lúc 2:38 chiều ngày hôm đó, Johnson đã tuyên thệ nhậm chức trên máy bay của tổng thống, Air Force One, khi nó đứng trên đường băng tại Love Field, Dallas, chờ đợi đưa thi hài Kennedy trở về Washington, D.C.. Trong một buổi chiều, Johnson đã bị đẩy vào vai trò khó khăn nhất - và được đánh giá cao nhất - trong sự nghiệp chính trị lâu dài của mình. Một trong những hành động đầu tiên của tổng thống mới là chỉ định một Ủy ban điều tra vụ ám sát Kennedy và vụ bắn chết Lee Harvey Oswald, kẻ ám sát được cho là đã bị giết hai ngày sau đó. Được chủ trì bởi Earl Warren, chánh án của Hoa Kỳ, Ủy ban Warren đã kết luận vào tháng 9 năm 1964 rằng không có âm mưu nào trong cái chết của Kennedy và vụ giết Lee Harvey Oswald, kẻ ám sát được cho là hai ngày sau đó. Ngay sau đó, chánh án của Hoa Kỳ, Ủy ban Warren đã kết luận vào tháng 9 năm 1964 rằng không có âm mưu nào liên quan trong cái chết của Kennedy.

Trong những ngày căng thẳng sau vụ ám sát, Johnson đã giúp làm dịu sự hiềm khích quốc gia và đảm bảo sự liên tục trong nhiệm kỳ tổng thống. Vào ngày 27 tháng 11, ông đã đề cập đến một phiên họp chung của Quốc hội và gợi lại ký ức về vị tổng thống tử vì đạo, thúc giục việc thông qua chương trình nghị sự lập pháp của Kennedy, đã bị đình trệ trong các ủy ban của Quốc hội. Ông đặt tầm quan trọng lớn nhất vào dự luật dân quyền của Kennedy, nơi trở thành tâm điểm của những nỗ lực của ông trong những tháng đầu tiên của nhiệm kỳ tổng thống. Càng không có tài liệu tưởng niệm hay điếu văn nào có thể tôn vinh một cách hùng hồn về Tổng thống Kennedy, ông nói về việc thông qua dự luật dân quyền sớm nhất có thể. Dự luật này hiệu lực hơn dự luật mà Kennedy đã đề xuất, và biện pháp cuối cùng đã được Thượng viện thông qua vào tháng 6, sau một cuộc "làm phim dài" 83 ngày của các đối thủ miền Nam.

Đạo luật Dân quyền, mà Johnson đã ký ban thành luật vào ngày 2 tháng 7 năm 1964, là đạo luật toàn diện và sâu rộng nhất trong lịch sử Hoa Kỳ. Trong số các điều khoản của nó là cấm phân biệt chủng tộc và phân biệt đối xử ở những nơi ở công cộng, cấm phân biệt đối xử theo chủng tộc hoặc giới tính trong việc làm và tư cách thành viên công đoàn, và đảm bảo mới về quyền bầu cử bình đẳng. Luật cũng ủy quyền cho Bộ Tư pháp đưa vụ kiện chống lại hội đồng trường địa phương để chấm dứt các hành vi bị cho là phân biệt đối xử, do đó đẩy nhanh sự phân chia trường học. Tính hợp hiến của đạo luật này ngay lập tức bị thách thức nhưng được Tòa án tối cao duy trì vào năm 1964.

Cơ quan việc làm cho người thất nghiệp và chương trình Head Start cho trẻ mẫu giáo; luật dân quyền mới, chẳng hạn như Đạo luật về quyền bỏ phiếu (năm 1965), ngoài vòng pháp luật về kiểm tra xóa mù chữ và các thiết bị khác được sử dụng để ngăn người Mỹ gốc Phi bỏ phiếu; và trợ cấp y tế, cung cấp các lợi ích sức khỏe cho người già và người nghèo. Những điều khác giải quyết các vấn đề trong giáo dục, phát triển nhà ở và đô thị, giao thông, bảo tồn môi trường và nhập cư. Johnson đã xem các biện pháp này khi xây dựng và hoàn thành tầm nhìn New Deal của Franklin D. Roosevelt; với sự chấp nhận của họ, Hoa Kỳ đã gia nhập hàng ngũ các quốc gia phúc lợi ở Tây Âu và Scandinavia. Tuy nhiên, hiệu quả của các chủ trương này đã sớm được tuyên bố bằng cách tăng cường sự tham gia của quân đội Mỹ vào cuộc chiến ở Việt Nam, bắt đầu từ thời chính quyền Eisenhower và được Tổng thống Kennedy đẩy nhanh tiến độ.